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[名人健康]

野生药用真菌配方组合对肿瘤细胞的抑制作用研究

北京陈康林野生真菌研究院 陈康林 100056          于 May 10, 2014 at 05:22:04:

[摘要]
目的:研究野生药用真菌配方组合对肿瘤细胞的抑制作用并与单方及经典化疗药物紫衫醇进行对比。
方法:分别取薄皮纤孔菌、云芝、试验品和紫杉醇提取物作用于子宫颈癌细胞株HeLa用SRB法测定OD值,计算药物对生长的抑制率和细胞50%生长抑制所需的药物浓度。
结果:试验品在50ug/L和500ug/L浓度时,对子宫颈癌Hela细胞的抑制作用显著高于同浓度的云芝及薄皮纤孔菌的抑制作用(P<0.01),在500ug/L浓度时与紫杉醇相比,无明显差异(P>0.05)。
结论:野生药用真菌配方组合对肿瘤细胞的具有明显的抑制作用,并且显示出比单方更具优势。

药用真菌是一类具有药用价值的真菌,其菌丝体、子实体、菌核或孢子中能产生大量氨基酸、蛋白质多糖、苷类、生物碱、黄酮类及萜类等多种物质,对肿瘤疾病有预防、抑制或治疗作用[1]。目前,已有大量研究证明木蹄层孔菌[2]、树舌[3]、桑黄[4]云芝[5]等单方应用对肿瘤细胞增殖的抑制作用明确,但国内对真菌配方组合对肿瘤细胞增殖的影响的研究较少,故本研究对此进行初步探索,初步研究发现药用真菌配方合剂对宫颈癌细胞株HeLa的体外抑制率能达到72.94%,阳性对照物紫杉醇为79.94%。此研究以期能为预防和治疗肿瘤疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1药品与药剂
1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司;四甲基耦氮唑盐(MTT)购自Cxbio生物技术有限公司;云芝、薄皮纤孔菌、试验品(真菌合剂由松针层孔菌2:华褐孔菌1:木蹄层孔菌2:树舌1:云芝1:薄皮纤孔菌1:粗毛褐孔菌1:灵芝1组成)、由北京陈康林野生真菌研究院提供,乙醇、纯净水由康科德公司提供。

1.2实验方法:

1.2.1真菌提取物的制备
分别取薄皮纤孔菌、云芝、试验品(合剂)各200g,粉碎成粉,加入1000ml的50%乙醇溶液,加热回流提取1h后,过滤,重复操作2遍,合并滤液,减压浓缩至流浸膏,干燥。

1.2.2细胞培养:子宫颈癌细胞株HeLa源自中国科学院上海细胞库,用含10%胎牛血清的1640 培养基,置于37℃5%CO2饱和湿度的孵箱中培养,Hela细胞为梭形,呈贴壁生长,孵育2-3d后用0.25%胰蛋白酶消化传代,选对数生长期细胞进行实验。

1.2.3SRB法测定提取物对肿瘤细胞增殖的影响
取对数生长期细胞接种于96孔培养板内,每孔100μl(含5000个肿瘤细胞),置37℃,5%CO2培养箱中培养;接种24h后,给药组加入不同浓度的真菌提取物(终浓度为0.5ug/L、5ug/L、50ug/L、500ug/L),每组每个浓度至少设三个平行孔。对照组加入与给药组等体积含0.1% DMSO浓度的培养液,置37℃,5%CO2培养箱中培养;加药同时,按照SRB方法测定此时初始对照组细胞的OD490nm:每孔加预冷的80%三氯乙酸(TrichloroaceticAcid,TCA)液50μl固定,静置5min,将96孔板移至4℃放置1h;倒掉固定液,去离子水洗5遍,空气干燥;每孔加入100μl 0.4% SRB液(1%醋酸配制),室温放置10min,1%醋酸洗5遍,空气干燥;用150μl 10mmol/L非缓冲Tris碱液(pH 10.5)溶解,用酶标仪在490nm波长处测定光密度值(OD);在48h后按照SRB实验方法测定加药组每孔OD值;按下列公式计算药物对生长的抑制率,并计算细胞50%生长抑制所需的药物浓度(GI50):

      对照组平均OD值-给药组平均OD值
抑制率= ————————————————————————×100%
          对照组平均OD值
GI50:[(T-T0)/ (C-T0)] =50

注: C表示对照组细胞的OD值
T表示加药组细胞的OD值

1.2.4统计方法 实验结果以均数±标准差表示,统计分析采用SPSS16.0软件,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
对子宫颈癌Hela细胞增殖的影响
云芝、薄皮纤孔菌、试验品(合剂)和紫杉醇作用于子宫颈癌Hela细胞24h后,对细胞增殖的抑制影响可见下表和图。
云芝、薄皮纤孔菌、试验品(合剂)和紫杉醇均对子宫颈癌Hela细胞的生长具有不同程度的抑制作用。试验品在50ug/L和500ug/L浓度时,对子宫颈癌Hela细胞的抑制作用显著高于同浓度的云芝的抑制作用(P<0.01);试验品在5ug/L浓度时对子宫颈癌Hela细胞的抑制作用较薄皮纤孔菌的抑制作用明显(P<0.05),50ug/L和500ug/L浓度时则抑制作用显著(P<0.01);但与阳性对照药紫杉醇相比,0.5ug/L和5ug/L浓度时,试验品对子宫颈癌Hela细胞的抑制作用显著弱于紫杉醇的抑制作用(P<0.01),在50ug/L浓度时,试验品对子宫颈癌Hela细胞的抑制作用明显增强,但仍明显低于紫杉醇(P<0.05),而高浓度500ug/L的试验品对子宫颈癌Hela细胞的抑制作用显著增强,与紫杉醇相比,无明显差异(P>0.05)。紫杉醇GI50为1.67×10-0.8mol/L,云芝GI50为7.4mg/mL,薄皮纤孔菌GI50为1.03mg/mL,试验品GI50为6.35 mg/mL。

表1 各组OD值
组别 药物浓度ug/L 云芝 薄皮纤孔菌 试验品 紫杉醇
对照组 - 0.83±0.003 0.07±0.001 0.80±0.005 0.79±0.003
阴性对照组 - 0.07±0.001 0.81±0.003 0.81±0.002 0.81±0.002
实验组 0.5 0.70±0.003 0.78±0.237 0.72±0.002 0.65±0.006ΔΔ
5 0.70±0.005 0.70±0.160 0.67±0.008# 0.51±0.006ΔΔ
50 0.61±0.010 0.52±0.156 0.44±0.012**## 0.27±0.006Δ
500 0.32±0.020 0.32±0.072 0.28±0.001**## 0.25±0.003
注:“-”表示缺省;
与云芝组同浓度比较,*P<0.05,** P<0.01;
与薄皮纤孔菌比较,# P<0.05,## P<0.01;
与试验品组比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。


图为各组细胞生长的抑制率

3 结论与讨论
通过云芝、薄皮纤孔菌、野生真菌试验品合剂三种提取物与紫杉醇对子宫颈癌Hela细胞增殖的实验结果表明,阳性对照药紫杉醇对hela细胞的半数有效抑制率为1.67×10-0.8mol/L,证明此方法可靠;云芝、薄皮纤孔菌和试验品(合剂)均对子宫颈癌Hela细胞的生长具有良好的抑制作用,尤其试验品合剂即松针层孔菌、木蹄层孔菌、桦褐孔菌、薄皮纤孔菌、硫磺菌、粗毛褐孔菌、云芝、灵芝的合剂对子宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用明显,在500ug/L浓度时,药用真菌复方合剂对子宫颈癌Hela细胞增殖的抑制率能达到72.94%,经典的抗肿瘤化疗药物紫杉醇为79.69%,二者相比较无明显统计学差异(P>0.05)。初步显示试验合剂所选8种真菌具有协同抗肿瘤作用,有利于提高对肿瘤的抑制作用,同时试验品(野生药用真菌合剂)使用过程中无骨髓抑制作用的产生,对消化道无明显刺激作用,甚至具有增强消化吸收的能力,对肿瘤患者的治疗具有积极的意义,但具体作用机理与作用途径有待进一步研究。

参考文献:
[1].徐锦堂.中国药用真菌学[M].北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1997.3.
[2]. 李旭阳,包海鹰. 木蹄层孔菌子实体提取物对H22荷瘤小鼠体内抗肿瘤活性的影响[J]. 菌物研究,2013,11(3):202-206.
[3]. 潘洪明,张可勇,于英君. 树舌多糖GF对肝癌细胞系H epA抑制作用研究[J]. 医学研究杂志,2007,36(8):81-82.
[4]. 杨全, 胡旭光,王琦等. 药用真菌桑黄菌丝体多糖抗肿瘤作用的研究[J]. 中国中药杂志.2006,31(20):1713-1715.
[5]. 祁永青,刁治民,刘涛等. 药用真菌云芝的研究概况[J]. 青海草业.2008,17(3):26-29.

陈康林(美国)野生真菌肿瘤康复中心地址:
11796 Wilcest Dr., Houston, TX77099, Texas
康复指导热线:832 573 8455
网址:www.bjchenkanglin.com




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